Молочный портал

Мы рассмотрим молочнокислое, спиртовое, пропионовокислое и маслянокислое брожения глюкозы (и молочной кислоты). Первые три вида брожения имеют важное значение при производстве кисло­молочных папитков и твердых сыров. Вместе с тем маслянокислое брожение является причиной возникновения пороков (порчи) мно­гих молочных продуктов и особенно сыров, вызывая получение не­правильного рисунка и позднее вспучивание продукта.

Молочнокислое брожение. Молочнокислое брожение глюкозы яв­ляется основным процессом при изготовлении заквасок, сыра и кис­ломолочных п род улетов, а молочнокислые бактерии — наиболее важ­ной группой микроортнизмов для молочной промышленности. Про­цесс молочнокислого брожения каждой гексозы молочного сахара вы­ражается суммарным уравнением

СбН, А + 2ФН + 2ДДФ —- 2С, Н<А + 2АТФ + Н20

Наряду с молочной кислотой могут образовываться и побочные продукты брожения.

Молочнокислые бактерии по характеру продуктов сбраживания глюкозы относят к гомоферментативным или гетероферментативным. Гомоферментативныс бактерии, как показывает их название, обра­зуют главным образом молочную кислоту (более 90%) и лишь незна­чительное количество побочных продуктов. Гетероферментативные бактерии около 50% глюкозы превращают в молочную кислоту’, а ос­тальное количество— в этанол, уксусную кислоту и СОг Однако про­вести резкую границу между гомо – и гетероферментативными молоч­нокислыми бактериями по образующимся продуктам брожения иног­да бывает трудно. Так, отмечены факты образования отдельными штаммами гомоферментативных молочнокислых бактерий (5тг. Шег – торЫ1ш и др.) от 8 до 30% побочных продуктов, а гетерофермента­тивные бактерии под воздействием ряда факторов могут нести себя как гомоферментативные.

Более характерным признаком при делении молочнокислых бак­терий на группы является путь сбраживания глюкозы (Е. И. Квасни­ков и О. А. Нестеренко, П. П. Степаненко). Гомоферментативные бак­терии (молочнокислые стреп гококки Lac. lactis, Lac. cremoris, Lac. di – acetylactis и др., термофильные и мезофильные молочнокислые папоч­ки Lbm. bulgaricum, Lbm. acidophьum, Lbm, caseisubsp. rhamnosusn др.) сбраживают глюкозу по гликолитическому пути Эмбдена-Мейергофа – Парнаса), гетероферментативные (Leu. cremoris, Leu, dextranicum, Leu. mesenteroides, Lbm. brevis) — пентозофосфатным путем (абифи – добактерии — фруктозофосфатным путем).

Гомоферментативное молочнокислое броже­ние. Механизм гомоферментативного молочнокислого брожения глюкозы к настоящему времени изучен подробно и представлен на рис. 6.1. Превращение глюкозы в пировиноградную кислоту в результате ряда последовательных реакций происходит при участии десяти ферментов.

В заключительной реакции пировиноградная кислота восстанав­ливается до молочной кислоты под действием фермента лактатдегид – рогеназы. Роль восстановителя при этом играет НАД * Н:, образовав­шийся в реакции окисления 3-фосфоглицеринового альдегида.

Следовательно, при гомоферментативном молочнокислом броже­нии из 1 моля глюкозы образуются 2 моля молочной кислоты (с од­новременным синтезом 2 молей АТФ).

При сбраживании глюкозы молочнокислыми бактериями могут образоваться два оптических изомера молочной кислоты: левовра – щающий Б(-)-лактат и правовращающий L(+)^aicTaT

TOC \o "1-3" \h \z COOH COOH

J J

Н—с—он МО—с—н 1 I

СНз СНз

D-Лактат L-Лактат

Изомеры отличаются расположением водородных атомов и гид – роксильных групп у асимметрического атома углерода, отмеченного звездочкой, — первый лактат имеет группу ОН справа и называется D – изомером (от лат. dexter—правый), второй имеет ее слева и поэто – му назван L-изомер ом (от лат. laevus — левый).

Большинство штаммов молочнокислых лактококков, термофиль­ный стрептококк и бифидобактерии преимущественно продуцируют

Глюкоза АТФ

‘АДФ

ГЛ нжозо – 6-фосфаг

Г1

1

Фру ктооо – 6 – фосфат. I – АТФ \р-АДФ Фруктозо-1,6-дифосфат

Глииерильдегид-З-фосфат ? > Диоксиацетон фосфат

НАДН2{2)^ ^

1,3-Дифосфоглицерат (2)

,И АДФ

АТФ

З-Фосфоглииерат (2)

!1

2-Фосфоглицерат(2)

Фосфоеналпируват (2) „к 2АДФ ^2 АТФ

Пяруват (2) 1»

ЦП) Лактат (2)

Рис. 6.1. Гликолитичсский путь расщепления глюкозы молочнокислыми бактериями.

Примечание. -Цифры на схеме оиозначаютферменты. катализируттцне реакции: I — гексокиназа; 2— глюкозофосфатизомерада; 3—фосфофрукто – киназа; 4— аладолаза; 5— триозофосфаттомсраза; 6~ глкиеральдегкдфос – фатдегидрогеказа; 7— фосфоглицерагкиказа; 8— фо. фоглииеромутаза; енолаза; 10 — пируааткз! паза; П — лактатдегидрогеназа

Ц+)-молочную кислоту, 1.Ьт. Ьи^апсит[11] и лейконосгоки — в основ­ном форму, ЬЬш. 11е1>еисит, ЬЬт. р1апшгит и ЬЬт. а^орИНит*

— оба изомера в почти одинаковых количествах, то есть оптически неактивную БЬ-молочную кислоту, или рацемат

1,-лактат является промежуточным продуктом обмена веществ в человеческом организме и легко превращается в пировиноград – ную кислоту, которая окисляется до СОг и Н20 в цикле трикарбо – новых кислот или используется для синтеза гликогена. В-лактат, наоборот, очень медленно распадается в организме, а новорожден­ные его вовсе не утилизируют. Поэтому продукты для вскармли­вания грудных детей не должны содержать О-форму молочной кислоты (или же содержать ее мало). Следовательно, для приго­товления детских кисломолочных смесей следует сочетать штам­мы микроорганизмов, образующие Ц+) или ВЬ-молочную кис­лоту, например, бифидобактерии и ацидофильную палочку (а при производстве йогурта — термофильный стрептококк и болгарскую палочку).

Молочная кислота может быть не единственным конечным продуктом гомоферментативного молочнокислого брожения. Ход брожения часто изменяется в зависимости от конкретных усло­вий (наличия С02, кислорода, рН, температуры среды и т. д.). Воз­можные метаболические пути превращения глюкозы гомофермен – тативными молочнокислыми бактериями (а также другими бакте­риями и дрожжами) представлены схемой на рис. 6,2, Как видно из приведенной схемы, в качестве побочных продуктов могут об­разовываться летучие и нелетучие органические кислоты, глице­рин, ацетальдегид, спирты, ацетон, ацетоин, диадетил, диоксид углерода и др.

Например, некоторые виды молочнокислых бактерий сбражива­ют часть глюкозы в этанол, уксусную и муравьиную кислоты (рис. 6,2, путь б).

Данный путь сбраживания глюкозы характерен для таких нети­пичных молочнокислых бактерий, как кишечная палочка Е. соИ. Суммарная реакция брожения глюкозы этими бактериями имеет следующий вид:

Ед А+н2о+зфн+задф —сгн3он+сн3соон+т:+гсо2+затф

Часть глюкозы может превращаться в янтарную, пропионовую, яблочную и другие органические кислоты (путь в). Могут образовы­ваться ацетон, изопропиловый и бутиловый спирты, а также масля­ная кислота (путь г). Возможно также превращение глюкозы в аро-

Яблочная кислота

I

Глюкоза

Глицерофосфат Глицерин

У – 2АТФ ¦ Триозофосфат

1,3-дифосфогл ицсрат

Пиру&ат {2 моля)

Щавелевоуксусная Ацетаньдегид*—Ацетил КоА-

(2 моля)

Муравьиная Кислота

2АТФ

Е Ацетил Ко А

Ос-Ацетолактат Диацетил Ацстоин

/ Ацетил - Фосфат Л

I лцч ^ I

•^со,

*АТФ

СО 2 Бута ндиол-2,3

Ацетагг

Янтарная кислота

Сукцинил-КоА 1

НБ-КоА

/

Метилималонил – КоА СО

Бутар ил-КоА Адетоацет&т

\

/

АТФ

Протшнил-КоА / ————— "" Буганол-1 Масляная / \ кислота Пропан ал-1 Пронионсвая кислота

Аистоацстил- КоА АТФ

^.со, Ахктон

Рис. 6.2. Возможные варианты превращения глюкозы по пути Эмбдена – Мейергофа-Парнаса (по Мецлеру, с изменениями)

Магические вещества: ацетоин, бутандиол-2,3, диаиетил (пути д и е). Однако эти вещества образуются из глюкозы лишь в небольших ко­личествах. Более значительное их количество образуется при сбра­живании лимонной кислоты (см. дальше).

Гетероферментативнос молочнокислое броже­ние. Бактерии группы лейконостоков и гетероферментативные молочнокислые пат очки (ЬЬш. р1апгагшп, ЬЬш. Ьгеуд и др.) не м01ут сбраживать глюкозу по гликолитическому пути, для ее расщепления они используют пентозофосфатпый (фосфоглюконатный. или гек – созомонофосфатный) путь. Это объясняется отсутствием у них клю­чевого фермента альдолазы, необходимого для расщепления фрук-

Глюкоза

А1ХР

‘АЛФ

Р Г-

Глкжозо-б-фосфат и НАДФ*

6 Фосфоглюконат иНАДФ* ?»НАДФ-Нг – Р ибулозо-5 – фосфтт

ГЬицеральдегид- 3-фосфат

НдЦ"

*над- нг — 1,3 – Д ифосфоглииерат

2 АЛФ "2 АТФ Пиру ват Ь* НАД-Н

Ацетальдегид Ь – НАДФН,- ¦рНАДФ* Этанол

Рис. 6.3. Пснтозофосфатный путь расщепления глюкозы гетероферментативными молочнокислыми бактериями

Етилфосфат ^ фиНАДФНГ

С

+ Ф„

С

Лактат

Тозо-1,6-дифосфата на две молекулы триозофосфата. Пснтозофос­фатный путь окисления глюкозы представлен на рис. 6.3.

В ходе реакций по пентозофосфатному пути из каждого моля глю­козы образуются моль молочной кислоты, моль этанола и СОг:

С6Н, А + Ф« + АДФ —^ С3Н603 + С, Н,ОН + СО, + АТФ.

Энергетический баланс брожения глюкозы, протекающего по это­му пути, составляет одну молекулу АТФ. В аэробных условиях воз­можно образование двух молекул АТФ, тогда ацетилфосфат превра­щается не в этанол, а в уксусную кислоту (см. рис. 6.3).

Фруктозо-6-фосфатный путь расщепления глю­козы бифидобактерипм и. Бифидобактерии (В. ЫГк1ит, В. 1оп§иш, В. аскМезсеп^з и др.) в отличие от пентозофосфатного пути превращают глюкозу не в глюкозо-6-фосфат, авофруктозо – 6-фосфат, который далее расщепляется фосфокетолазой на эритрозо-4-фосфат

2 Глюкоза

2АТФ Г*2АДФ

Г

Фруктозо-6-фосфат

Фру ктозо-б-фос фат

Структурная перестройка сахара

Эритроэо-4 – фосфат.

Ацетилфосфат С – АДФ 2 Пен тозо – 5 – фосфат |^АТФ

2 Гли ц. ералвдетвд-3-фосфат 4АДФ 2НАД4

4АТФ*ф»2НАД-Н,-| 2 Пируват

Рис. 6.4. Путь сбраживания глкжозы бнфшхобактериями

2 Лактат

Г’

И ацетилфосфат (рис, 6.4). Затем эритрозо-4-фосфат и фруктозо – 6-фосфат под действием ферментной системы перестройки Сахаров превращается в два моля пентозофосфата (ксилулозо-5-фосфата и рибозо-5-фосфата). Далее пентозофосфат расщепляется на ацетил­фосфат и глицеральдегид-3 фосфат, который переходит в пируват (Е. И. Квасников и О. А. Нестеренко).

На последней стадии пируват восстанавливается долактата (а аце­тилфосфат превращается в ацетат). Таким образом, образование ук­сусной и молочной кислот происходит н молярном отношении 3 : 2. Выход АТФ составляет 2′/, моля на 1 моль глюкозы. Цитраты бифи – добактерии не используют.

Бифидобактерии имеют низкую галактоз идазну го активность и плохо развиваются в молоке. Для стимуляции их роста целесооб­разно в закваски вводить культуры термофильного стрептококка, обладающего повышенной р-галактозидазной активностью.

Спиртовое брожение. Спиртовое брожение глюкозы имеет место при выработке кефира, кумыса, курунги и других кисломолочных продуктов. Возбудителями спиртового брожения являются дрожжи родов ЗассЬаготусез, ?увовассИаготусеБ, РаЬозрога, Тоги1ор$15 и др.

Они сбраживают глюкозу с образованием этанола и диоксида угле­рода:

С6Н, А + 2Ф,, + 2АДФ———— 2СЛЦОН + 2СОг + 2АТФ.

Выход АТФ при спиртовом брожении составляет 2 моля на 1 моль глюкозы.

Превращение глюкозы в пировинограаную кислоту на первой ста­дии спиртового брожения идет по гликолитическому пути аналогич­но – гомоферментативному молочнокислому брожению (см. рис. 6.1). Однако вместо восстановления до молочной кислоты она подверга­ется декарбокси лированию под действием пируватдекарбоксилазы с образованием СО, и уксусного альдегида. Уксусный альдегид далее вступает во взаимодействие с НАД ¦ Н2> образовавшимся ранее при окислении 3-фосфоглиперинового альдегида. В результате образует­ся этанол:

СН5СОСООН———- СН3СНО + со2,

СН3СНО + НАД И,——— – С2Н5ОН + НАД1

Кроме этанола и диоксида углерода дрожжи могут образовывать в небольшом количестве другие спирты (изобутиловый, пропиловый, глицерин и др.), уксусную, пропионовую, янтарную и молочную кис­лоты, а также ацетальдегид, ацетоин и диацетил.

Окисление спирта уксуснокислыми бактерия – м и. При совместном культивировании дрожжей и уксуснокислых бактерий, например при использовании кефирных грибков, проис­ходит неполное окисление части накопившегося этанола до уксус­ной кислоты (с образованием более 5% кислоты): – 2Н + н:о + ‘/гог

СН, СН2ОН —- СНОСНО • СН? СН(ОН)г —- СН3СООН + н, о

Уксуснокислые бактерии относятся к роду Асе1оЬас1ег (виды А. асе и и др.), по типу питания являются облигатными аэробами, то есть растут при доступе кислорода воздуха на поверхности мо­лочных продуктов. Чистые культуры уксуснокислых бактерий плохо развиваются в молоке, так как не усваивают лактозу — источ­никами углерода для них служат этанол и лактат. Однако их рост усиливается при совместном культивировании с дрожжами (и мо­лочнокислыми бактериями).

В кефире, приготовленном на чистых культурах, уксуснокислые бактерии постепенно вытесняют дрожжи и накопление спирта прек­ращается. Вместе с тем и кефире, выработанном на кефирных гриб­ках, дрожжи не исчезают полностью. Вероятно, они находятся в ме­табиозе — дрожжи, образуя этанол, создают условия для развития уксуснокислых бактерий. Однако при излишнем развитии уксусно­кислых бактерий происходит ослизнение кефирных грибков и об­разование тягучей консистенции закваски.

СН^СОСООН

Пропионовокислое брожение. Возбудителем брожения являют­ся пропионовокислые бактерии рода Propionibacterium (Р. freuden- reichii и др.), которые превращают глюкозу или молочную кислоту в пропионовую и уксусную кислоты с выделением диоксида угле­рода, Если брожение начинаегся с глюкозы, то процесс до образо­вания пиро нин оград ной кислоты идет аналогично гомофермента – тивному молочнокислому брожению. Если же брожению подвер­гается молочная кислота, то путем дегидрирования (с помощью лактатдегидрогеназы) она также превращается в пировиноградную кислоту. В дальнейшем одна часть пировиноградной кислоты под­вергается окислительному декарбоксилированию с образованием ацетил-КоА, который через ацетилфосфат переходит в уксусную кислоту:

О

HS-КоА, НДЦ+ //———- +Фн гл Н3С—С\ I

-С°2 ^-SKoA – HS КоА

+ ф" – н, с-/ – сн, соон

- НБ-КоА ‘ ‘^.ф ддф д-|ф

Друтая часть пирояиноградной кислоты путем карбоксилирова – нии пренращается в щавелевоуксусную кислоту Далее щавелевоук – сусная кислота восстанавливается в яблочную, которая в свою оче­редь восстанавливается в янтарную кислоту. Янтарная кислота через сукцинил-КоА и метилмалонил-КоА превращается в пропионил – КоА, который расщепляется с образованием пропионовой кислоты (см. аналогичные этапы на рис. 6.2, путь в).

Суммарное уравнение пропионовокислого брожении глюкозы (если одна треть молекул глюкозы превращается в уксусную кислоту, а две трети — в пропионовую) имеет следующий вид:

ЗС6Н, А + 8Ф, + 8АДФ —-

——- 4СНзСН? СООН + 2СН?ООН + 1С02 I – 2Н,0 + 8АТФ.

Общий энергетический выход составляет 22/, моля АТФ на I моль глюкозы.

Пропионовокислое брожение углеводов и молочной кислоты иг­рает важную роль в процессе созревания твердых сыров с высокой температурой второго нагревания.

Маслянокиелое брожение. Брожение происходит в молочных про­дуктах под действием маслянокислых бактерий (С1. Ьигупсит, С1,1угоЬи1упсит и др.), сбраживающих как глюкозу, так и молочную кислоту. Известно несколько типов маслянокислого брожения, раз­личающихся образуемыми продуктами. Так, конечными продуктами одного из типов брожения являются масляная и уксусная кислота, диоксид углерода и водород:

2С6Н, А + 2Н20 + 7ФН + 7АДФ———

——- СН-,СН2СН2СООН + 2СН, СООН + 4С02 6Н2 + 7АТФ

Выход АТФ оказывается равным З’Д моля на 1 моль глюкозы. До образования пировиноградной кислоты брожение идет по гликоли – тическому пуги. Затем пировинофадная кислота декарбоксилирует – ся до ацетил-КоА. Одна часть молекул ацетил-КоА переходит в ане – тилфосфат и далее в уксусную кислоту (см. путь г на рис. 6,2). Другая часть ацетил-КоА конденсируется в ацетоацетил-КоА, который че­рез ряд реакций превращается в масляную кислоту, обладающую в больших концентрациях неприятным прогорклым запахом.

Кроме того, в процессе маслянокислого брожения наряду с мас­ляной кислотой образуется большое количество газон. Маслянокис- лое брожение — нежелательный процесс в молочной промышленно­сти. Продукты жизнедеятельности маслянокислых бактерий являются причиной появления в кисломолочных продуктах неприятного вку­са, запаха, а в сырах — позднего вспучивания.